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如何讓樣品保持在生理狀態(tài)

點擊次數(shù):519 更新時間:2023-09-05

Coral Life工作流將動態(tài)數(shù)據(jù)與最佳的樣品固定方式(高壓冷凍)相結合。


 

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Coral Life工作流將動態(tài)數(shù)據(jù)與最佳的樣品固定方式(高壓冷凍)相結合。然而,如果您的細胞因為溫度下降,或缺氧氣、二氧化碳或營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而受到損傷,那么再好的樣品保存也沒有意義。這些因素將影響一系列的生物過程,甚至破壞原超微結構基礎,影響您的分析。

 

因此,徠卡顯微系統(tǒng)公司與Baker Ruskinn公司合作開發(fā)了一種方法,可使您的樣品從細胞接種開始到高壓冷凍,一直保持生理狀態(tài)。使用這種解決方案,樣品的生長、選擇和成像沒有任何時間壓力。本文描述了控制氧氣的重要性,以及Coral Life如何協(xié)同Baker Ruskinn公司解決氧氣控制的問題。


 


 


 


為什么持續(xù)控制氧氣特別重要?

氧氣是大多數(shù)生命形態(tài)存在的基本要素。對于生命科學研究人員而言,氧氣是一種電子受體,一種生命所必需的高活性分子,以及一種影響生物中每一個單一活動和反應的分子。一般情況下,大氣含氧量被認為是21%。

 

然而,當吸入空氣時,組織氧合下降到約5%。從肝至肺上皮中,氧氣水平約為14%,腸粘膜腔實際上是無氧的。在這些百分比中,不同的組織中有不同的氧氣水平,但最重要的是,沒有一個組織的細胞會暴露在21%的氧氣水平中。事實上,21%的氧氣會形成活性氧自由基(ROS)及其中間體,因此對細胞具有高毒性。當產(chǎn)生的ROS超過細胞的抗氧化能力時,ROS就開始破壞大分子,如蛋白質(zhì)、脂類和DNA。

 

缺氧是細胞和組織通過血流增加、血管舒張或上調(diào)氧應答基因對一定的氧氣水平作出響應,以期維持它們的氧氣水平。這些響應會在氧氣水平低于某一特定點后發(fā)生,這個點在各組織和細胞間各不相同。正常組織在3%到10%的氧氣水平之間得以維持,低于該水平被視為低氧狀態(tài)(最恰當?shù)拿枋鍪侨毖酰?/p>

 

由于是在非生理條件下進行研究,因此,在很多,甚至可能是大部分的研究中都要隱藏生理表型。由此,了解各項研究中器官或組織的氧氣水平,以獲得可轉移的和生物學相關的實驗結果是很重要的。每個組織和器官都有各自的氧合狀態(tài),反映了各自的功能。當氧氣含量過高或過低時,其影響涉及單基因表達到蛋白質(zhì)組水平。

 

Baker Ruskinn公司的OxyGenie

OxyGenie是一個小型便攜式孵育平臺,可將您的樣品保持在缺氧狀態(tài)或您想要的空氣中。OxyGenie可以由電源以及電池驅動,不管是在實驗室,還是外面 , 您都可以控制樣品狀態(tài)。它由1至6個獨立的1孔培養(yǎng)室組成,每個培養(yǎng)室有自己的進氣口。OxyGenie配有兩個循環(huán)充氣瓶(Catalina Cylinders,美國加利福尼亞州),可以充您想要的氣體成分比例。通過調(diào)整氣瓶的出口壓力來調(diào)節(jié)氣體流量。兩個裝滿的氣瓶可供6個樣品室使用16小時。溫度由ITO加熱器和控制器(Okolab s.r.l.,意大利)控制。每個樣品室下方都有一個6孔分流器,通過該分流器,細胞可以在不中斷生理參數(shù)的情況下,例如在光學顯微鏡成像時與基底分離。

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圖1. A:Baker Ruskinn OxyGenie移動式孵化器。B:組裝硅細胞培養(yǎng)孔

樣品室經(jīng)過優(yōu)化,以實現(xiàn)高分辨率成像。樣品室的底座為高質(zhì)量的玻璃蓋。每個樣品都是一個迷你孵化器,配有不同的蓋子和鎖。經(jīng)過優(yōu)化的樣品室可容納1mL的樣品培養(yǎng)基,并以光學透明玻璃蓋密封。蓋鎖是為了預防潛在的蒸發(fā)。外蓋鎖將蓋子牢固密封。最后一層外蓋與系統(tǒng)的氣體軟管連接。

 

 

為Coral Life改編

為了在整個活細胞CLEM工作流中維持合適的生理條件,我們利用了OxyGenie可以在冷凍固定之前確保細胞生理狀態(tài)的能力。然而,為了適應工作流的需要,我們做了一些定制化的改變:

 

在EM ICE上進行高壓凍結時,使用6 mm的藍寶石盤作為樣品培養(yǎng)皿。此外,為了實現(xiàn)最佳的實時成像,能否在藍寶石盤上實現(xiàn)水浸式成像至關重要。因此,我們將腔室底部的玻璃蓋換成一個在中心有6.5 mm孔的35 × 35 × 1 mm玻璃載玻片(稱為SampLink樣品杯)。該孔與EM ICE中間板對齊,直達藍寶石盤的中心。使用蠟封將中間板和藍寶石基底連接到SampLink基杯的底部。中間板與SampLink基杯的對齊和連接見Coral Life操作手冊的5.2節(jié)的描述。

 

成像后,EM ICE中間板必須快速脫離SampLink。因此,EM ICE加樣區(qū)配備了滑動和分離機制,可將中間板從玻璃基底分離,并將其直接放置在正確的位置進行冷凍。

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圖2:為Coral Life準備的EM ICE加載區(qū)。


 

 

 


SampLink室的細胞活性和細胞毒性

為確保樣品在改良后的SampLink室中保持活性,需要開展細胞活性和細胞毒性測試。實驗使用哺乳動物的成纖維細胞系L-929 (ATCC編號CCL-1,批號13),由奧地利維也納的OFI技術與創(chuàng)新公司執(zhí)行。細胞(105細胞/ ml)接種在藍寶石盤上(50 μl)或整個樣品室底部(500 μl)。作為對照,將相同的稀釋細胞接種在96孔板(50 μl)或12孔板(500 μl)中。樣品和對照品在37°C和5%二氧化碳水平下孵育24小時。測試細胞毒性,以評估牙蠟對種子細胞質(zhì)量的影響(圖3)。根據(jù)ISO 10993--5:2009標準測定細胞毒性。

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圖3:可見與EM ICE中板接觸的、在藍寶石盤側的牙蠟(紅色圈)。

 

為進行光學評估,用MTT對樣品進行了染色

活細胞可將MTT轉化生成甲臜,顏色由黃色變?yōu)樽仙?藍色,可通過光度計的吸收測量來檢測。去除培養(yǎng)基,用50 μl或500 μl MTT溶液(DMEM中1 mg/ml)對細胞進行染色,在37℃,5%二氧化碳水平中孵育2小時。然后用50 μl或500 μl異丙醇替代染色劑。將溶液轉移到96孔板上,在波長范圍560 ~ 650 nm內(nèi)測量吸收。細胞形態(tài)學的光學評估顯示,試驗樣品和對照樣品均為正常的成纖維細胞,如圖4所示。

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圖4:用MTT染色的陰性對照樣品


 

 

 


所有測試樣品的細胞活性為85±7%

結合形態(tài)學的評估,Coral Life工作流清楚地顯示,SampLink室作為非常合適的實驗工具,可以在任何活細胞實驗中,將您感興趣的細胞保持在特定的生理狀態(tài)。


 


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