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冷凍斷裂與冷凍蝕刻基礎(chǔ)介紹
點擊次數(shù):681 更新時間:2023-04-24
揭示生物學(xué)樣本和材料樣本原本無法觀察到的內(nèi)部結(jié)構(gòu)
冷凍斷裂是一種將冰凍樣本劈裂以露出其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)。冷凍蝕刻是指讓樣本表面的冰在真空中升華,以便露出原本無法觀察到的斷裂面細(xì)節(jié)。金屬/碳復(fù)合鍍膜能夠?qū)崿F(xiàn)樣本在SEM(塊面)或TEM(復(fù)型)中的成像,主要用于研究如細(xì)胞器、細(xì)胞膜,細(xì)胞層和乳膠。這項技術(shù)傳統(tǒng)上用于生物學(xué)應(yīng)用,但現(xiàn)在逐漸在物理學(xué)和材料科學(xué)中展現(xiàn)出重要意義。近年來,研究人員通過冷凍斷裂電子顯微鏡,尤其是冷凍復(fù)型免疫標(biāo)記(FRIL),對膜蛋白在動態(tài)細(xì)胞過程中所發(fā)揮的作用有了新的見解。
作者:Gisela H?flinger
圖1:麥葉上的蚜蟲
適合于電子顯微鏡的環(huán)境
電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降*低壓力。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無法有效保全結(jié)構(gòu),因為細(xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會快速蒸發(fā)。
生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被(固定)保存,這樣后續(xù)脫水對原位結(jié)構(gòu)的破壞小,同時可以使用環(huán)境掃描電鏡(SEM)或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰(從水變?yōu)榱呅伪鶗r體積會增加)而是無定形冰,因此體積保持不變。所以,對滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留(見文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹")。
要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu),冷凍斷裂是一種方法。通過刀片(或類似物)或釋放彈簧負(fù)載的外力來破開冷凍樣本,并沿著小阻力線斷裂樣本。
電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降*低壓力。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無法有效保全結(jié)構(gòu),因為細(xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會快速蒸發(fā)。
生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被(固定)保存,這樣后續(xù)脫水對原位結(jié)構(gòu)的破壞小,同時可以使用環(huán)境掃描電鏡(SEM)或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰(從水變?yōu)榱呅伪鶗r體積會增加)而是無定形冰,因此體積保持不變。所以,對滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留(見文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹")。
要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu),冷凍斷裂是一種方法。通過刀片(或類似物)或釋放彈簧負(fù)載的外力來破開冷凍樣本,并沿著小阻力線斷裂樣本。
圖2:冷凍斷裂
水的升華與凝結(jié) – 冷凍蝕刻與污染
要暴露冷凍斷裂面,需要把冰去除。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu)。升華的過程是冰不經(jīng)過液態(tài)過程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。而液態(tài)過程會導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞。
要暴露冷凍斷裂面,需要把冰去除。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu)。升華的過程是冰不經(jīng)過液態(tài)過程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。而液態(tài)過程會導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞。
圖3:ES,細(xì)胞外表面;PF,細(xì)胞膜冷凍斷裂面;EF,細(xì)胞膜外層冷凍斷裂面;FS,細(xì)胞膜內(nèi)表面;Cyt,細(xì)胞質(zhì)
水的升華/冷凝過程取決于特定溫度下的飽和壓力,以及水或冰在室內(nèi)的有效水分壓。
注意:良好的真空度會降低水分壓。
例如:溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個壓力,則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài)。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量。在更高壓力下,冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會在樣本表面上生長。必須采取一切手段來避免這種情況。樣本上方一個較冷(比樣本更冷)的冷阱會降低局部壓力,從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上。在低于飽和壓力的壓力下,更多的分子升華而不是冷凝,同時會發(fā)生冷凍蝕刻。
執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本*無冰,這一過程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時間內(nèi)執(zhí)行的小樣本。該過程分為幾個步驟,需要從大約-120℃加熱到-60℃,同時在每個步驟上使溫度保持一定時間。該過程需要幾天的時間來完成。
注意:良好的真空度會降低水分壓。
例如:溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個壓力,則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài)。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量。在更高壓力下,冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會在樣本表面上生長。必須采取一切手段來避免這種情況。樣本上方一個較冷(比樣本更冷)的冷阱會降低局部壓力,從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上。在低于飽和壓力的壓力下,更多的分子升華而不是冷凝,同時會發(fā)生冷凍蝕刻。
執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本*無冰,這一過程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時間內(nèi)執(zhí)行的小樣本。該過程分為幾個步驟,需要從大約-120℃加熱到-60℃,同時在每個步驟上使溫度保持一定時間。該過程需要幾天的時間來完成。
圖4:飽和蒸汽壓力(感謝Umrath 1982提供的圖片)
樣本溫度低于-120℃時,蝕刻速度非常慢,蝕刻持續(xù)時間會增加到不切實際的程度。如果真空室的壓力固定,則可以通過提高樣本溫度來提高蝕刻速度。對于生物樣本,要特別小心溫度高于-90℃。蝕刻速度會大幅提高。另外,要注意玻璃態(tài)冰中形成六邊形冰晶從而導(dǎo)致脫水偽像。
純水的理論升華速度會降低,因為:
樣本深處的水升華速度比表面的水更慢。
鹽和大分子溶劑會降低升華速度。
生物樣本中大量存在的結(jié)合水會降低升華速度。
通過冷凍斷裂生成圖像
冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術(shù)往往采用高真空精細(xì)鍍膜技術(shù),將超細(xì)膩重金屬和碳薄膜沉積于斷裂表面。
冷凍斷裂樣本在一定角度下用金屬覆蓋,然后在碳背襯膜(徠卡EM ACE600冷凍斷裂或徠卡EM ACE900與徠卡EM VCT500)上生成復(fù)型進(jìn)行TEM成像或在SEM的試塊面上進(jìn)行成像。
對于這兩種方法,冷凍斷裂表面經(jīng)過一定的蝕刻時間后以相同的方式進(jìn)行鍍膜。首先在一定角度下進(jìn)行一層薄的(2-7nm)重金屬鍍膜,以形成地形對比度(陰影)。其次再針對重金屬薄膜,在90°下進(jìn)行一層厚的碳層(15-20nm)鍍膜,以穩(wěn)定超薄電子束蒸發(fā)。此時的蝕刻處理會停止。要對極小的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,需要在極低的角度(2–8°)鍍膜重金屬并在鍍膜期間旋轉(zhuǎn)樣本。這樣可增加細(xì)絲狀及其它細(xì)小結(jié)構(gòu)的對比度。此項技術(shù)又稱為小角度旋轉(zhuǎn)投影。
蒸鍍重金屬薄膜需要采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)。這種鍍膜技術(shù)可實現(xiàn)精細(xì)定向沉積。碳的支撐層穩(wěn)定了未被金屬覆蓋的結(jié)構(gòu)。隨著溫度的升高,這些結(jié)構(gòu)會改變它們的輪廓,樣本不會*導(dǎo)電,復(fù)型也不會粘在一起。
冷凍斷裂酵母的單向投影
圖5:低溫SEM,BSE(背散射電子)圖像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.(1995)雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237。
圖6:復(fù)型,TEM圖像(感謝Electronmicroscopy ETH Zürich提供圖片)。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.(1995)雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237。
圖7:徠卡高壓冷凍,真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中,利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。油/水基樣品,–100℃(升華)3分鐘暴露油脂結(jié)構(gòu)。
圖8:徠卡高壓冷凍,真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中,利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。原生生物游仆蟲混合培養(yǎng)的羽紋硅藻。感謝英國波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供圖片
圖9:徠卡冷凍斷裂系統(tǒng)及徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM的HPF、冷凍斷裂、冷凍蝕刻和低溫鍍膜。油/水基乳液破裂,露出洋蔥狀薄片結(jié)構(gòu),形成液滴。感謝漢堡拜爾斯多夫Stefan Wiesner博士提供的圖片。
圖10:TEM中的酵母細(xì)胞復(fù)型。經(jīng)徠卡高壓冷凍和徠卡冷凍斷裂復(fù)型制備。感謝Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的圖片。
圖11:大麥葉上的真菌。安裝于徠卡冷凍斷裂儀樣本臺上,并通過冷卻樣本臺在液氮下進(jìn)行冷凍。徠卡冷凍斷裂儀對樣品進(jìn)行部分冷凍干燥(在更高的樣本溫度下冷凍干燥)。使用鎢鍍膜。徠卡真空冷凍傳輸至低溫FESEM 5keV。
圖9:徠卡冷凍斷裂系統(tǒng)及徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM的HPF、冷凍斷裂、冷凍蝕刻和低溫鍍膜。油/水基乳液破裂,露出洋蔥狀薄片結(jié)構(gòu),形成液滴。感謝漢堡拜爾斯多夫Stefan Wiesner博士提供的圖片。
圖10:TEM中的酵母細(xì)胞復(fù)型。經(jīng)徠卡高壓冷凍和徠卡冷凍斷裂復(fù)型制備。感謝Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的圖片。
圖11:大麥葉上的真菌。安裝于徠卡冷凍斷裂儀樣本臺上,并通過冷卻樣本臺在液氮下進(jìn)行冷凍。徠卡冷凍斷裂儀對樣品進(jìn)行部分冷凍干燥(在更高的樣本溫度下冷凍干燥)。使用鎢鍍膜。徠卡真空冷凍傳輸至低溫FESEM 5keV。
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