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如何為免疫熒光顯微鏡制備樣本
點擊次數(shù):904 更新時間:2022-06-23
樣本
IF方案存在于多種不同的樣本當(dāng)中。簡單常用的方法是對細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)(真核)細(xì)胞進(jìn)行染色。貼壁生長的細(xì)胞可以接種在蓋玻片上,采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養(yǎng)皿上并在所需的時間用于IF檢查。IF還可在細(xì)胞涂抹于載玻片(例如細(xì)胞離心涂片)后用于懸浮細(xì)胞的檢查。在這兩種情況下,需重點分析細(xì)胞內(nèi)的過程或結(jié)構(gòu),這被稱為免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)。
另一方面,在免疫組織化學(xué)(IHC)typo3/當(dāng)中通過組織特定的環(huán)境聯(lián)系來檢查是否存在蛋白質(zhì)或分子。此處器官制備的超薄切片(通常包埋在石蠟中)用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。
除了制備組織切片外,還可以對整個生物體進(jìn)行IF檢查,這一過程被稱為“整體IHC"。為此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚等,或植物模型如擬南芥。在整體IHC中會受到試樣尺寸和相關(guān)IF試劑透化深度的限制。單獨的孵育步驟比培養(yǎng)細(xì)胞的染色要長。此外還必須提供帶有特殊光學(xué)設(shè)備的顯微鏡用于大樣本分析。
IF方案存在于多種不同的樣本當(dāng)中。簡單常用的方法是對細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)(真核)細(xì)胞進(jìn)行染色。貼壁生長的細(xì)胞可以接種在蓋玻片上,采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養(yǎng)皿上并在所需的時間用于IF檢查。IF還可在細(xì)胞涂抹于載玻片(例如細(xì)胞離心涂片)后用于懸浮細(xì)胞的檢查。在這兩種情況下,需重點分析細(xì)胞內(nèi)的過程或結(jié)構(gòu),這被稱為免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)。
另一方面,在免疫組織化學(xué)(IHC)typo3/當(dāng)中通過組織特定的環(huán)境聯(lián)系來檢查是否存在蛋白質(zhì)或分子。此處器官制備的超薄切片(通常包埋在石蠟中)用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。
除了制備組織切片外,還可以對整個生物體進(jìn)行IF檢查,這一過程被稱為“整體IHC"。為此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚等,或植物模型如擬南芥。在整體IHC中會受到試樣尺寸和相關(guān)IF試劑透化深度的限制。單獨的孵育步驟比培養(yǎng)細(xì)胞的染色要長。此外還必須提供帶有特殊光學(xué)設(shè)備的顯微鏡用于大樣本分析。
圖1 COS7有絲分裂細(xì)胞。染色質(zhì)(青色,mCherry),有絲分裂紡錘體(黃色,EGFP),高爾基體(紅色,Atto647N),線粒體(綠色,AF532),肌動蛋白絲(紫色,SiR700)。樣片提供:蘇黎世大學(xué)Jana D?hner和Urs Ziegler。
清洗步驟
在IF程序中應(yīng)特別注意清洗步驟,因為適當(dāng)?shù)那逑纯梢蕴岣逫F質(zhì)量。PBS是一種標(biāo)準(zhǔn)的清洗緩沖液,而PBS++或PBS-T等變體也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2,推測其具有防止細(xì)胞分離的膜穩(wěn)定作用。對于PBS-T,添加最終濃度為0.05%的清潔劑Tween 20,目的是增加抗體的結(jié)合特異性。請務(wù)必注意小心地涂抹并吸取清洗緩沖液以免細(xì)胞從培養(yǎng)容器或蓋玻片上脫落。如有足夠的時間,請在吸取緩沖液時等待幾分鐘,以確保清洗緩沖液有效擴散到樣本中。IF程序的各個清洗步驟在下面的標(biāo)準(zhǔn)方案中列出。
傳統(tǒng)IF反應(yīng)的各步驟描述如下。本文結(jié)尾附有常用的間接IF與培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)程序。
固定
固定是IF程序的第一步。其目的是保持細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織處于其當(dāng)前狀態(tài),并通過化學(xué)試劑長期保存。在固定過程中,重要的是細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持其原有的構(gòu)象。不同的固定方法對IF有用,每種試劑對一抗表位有不同的影響??贵w結(jié)合位點可能被掩蓋或被固定所破壞,這會損害IF染色質(zhì)量。由于每種抗體以不同的方式與抗原結(jié)合依賴于不同的固定化合物,因此有必要嘗試幾種新抗體的固定方法。
通常,合適的固定劑規(guī)格可以在抗體的數(shù)據(jù)表上找到。理想的固定應(yīng)能夠保存細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),并為良好的抗體結(jié)合暴露出抗原。實際上,您必須在兩者之間取得平衡。
固定試劑可以大致劃分成2組:化學(xué)交聯(lián)劑和有機溶劑。
化學(xué)交聯(lián)劑如通過游離氨基形成的福爾馬林交聯(lián)蛋白;細(xì)胞形態(tài)在大多數(shù)情況下保存良好。但抗原也可能發(fā)生交聯(lián),進(jìn)而可能減少抗體結(jié)合。戊二醛對細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有保存固定作用,但會導(dǎo)致顯微鏡下觀察到樣本有很強的自發(fā)熒光(見‘對照’章節(jié))。
有機溶劑如甲醇或丙酮等具有脫氫作用并沉淀蛋白質(zhì),從而將其固定在細(xì)胞環(huán)境中。但切記,在該過程中可溶性分子和許多脂質(zhì)成分都會丟失。通常將甲醇和丙酮組合使用,因為盡管甲醇適合保存細(xì)胞結(jié)構(gòu),但它對許多表位有極其不利的影響,而丙酮卻破壞性較小。除此還應(yīng)該考慮到已經(jīng)存在于細(xì)胞中的熒光蛋白(如GFP),會因被有機溶劑固定而在很大程度上被破壞。如果一抗的制造商未建議使用何種固定劑,則用4%福爾馬林在室溫下處理10分鐘即可用于各種細(xì)胞系和抗原。
表1:固定試劑
透化
通過透化處理,抗體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),否則抗體就無法通過細(xì)胞的脂膜。根據(jù)固定類型,有時需要單獨的透化處理。當(dāng)用有機溶劑固定時,細(xì)胞膜已經(jīng)具有滲透性,您可以直接進(jìn)入封閉步驟。用化學(xué)交聯(lián)劑固定的細(xì)胞需要用清潔劑進(jìn)行額外處理以實現(xiàn)透化。使用Triton X-100或NP-40等傳統(tǒng)清潔劑,但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。同樣,根據(jù)應(yīng)用的物質(zhì)、濃度和培養(yǎng)時間會得到不同的結(jié)果,因此實驗人員應(yīng)該在開始時嘗試不同的參數(shù)。典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。
如果希望通過IF來分析脂質(zhì)相關(guān)蛋白或膜蛋白,則應(yīng)謹(jǐn)慎開展透化步驟(=脂質(zhì)去除)。比較理想的選擇是皂甙,能選擇性去除質(zhì)膜上的膽固醇,使細(xì)胞內(nèi)的膜基本上完好無損。如果在抗體染色前忽略了透化處理(只能通過化學(xué)交聯(lián)劑固定),則可以專門標(biāo)記細(xì)胞外質(zhì)膜結(jié)合抗原,以便將其與胞內(nèi)抗原分開來。核酸染料如DAPI或Hoechst(見‘細(xì)胞核染色和樣本封固’章節(jié))具有膜滲透性,因此不需要透化處理。
封閉
封閉是在細(xì)胞內(nèi)最大限度降低一抗非特異性結(jié)合的重要步驟。為了實現(xiàn)這一點,可以使用來自牛血清白蛋白(BSA)、奶粉或血清的蛋白質(zhì)。關(guān)鍵在于,這些封閉蛋白質(zhì)并不源于產(chǎn)生一抗的物種,否則二抗對于一抗的特異性就會損失。如果您使用的是二抗,如山羊產(chǎn)生的抗小鼠一抗,則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。通常使用濃度為1%(奶粉,BSA)至5%(正常血清)的封閉溶液,并在清洗緩沖液中稀釋。在室溫下孵育30-60分鐘。
免疫反應(yīng)
經(jīng)固定、透化和封閉制備樣本后,會開始進(jìn)行免疫反應(yīng)。樣本現(xiàn)在與特定的一抗一起孵育,以標(biāo)記所需的靶結(jié)構(gòu)。幾種一抗可同時應(yīng)用于樣本。如上所述,在間接多色I(xiàn)F中,幾種一抗必須來源于不同的物種。首先根據(jù)制造商的要求,在選定的封閉溶液中進(jìn)行抗體稀釋。如果對染色不滿意,或者如果制造商沒有提供任何有關(guān)有效稀釋的信息,您應(yīng)該嘗試使?jié)舛缺3衷?:50到1:1000之間。根據(jù)抗體的親和力,孵育時間可能會有所不同。默認(rèn)培育時間為室溫下1-2小時;也可以在4℃下過夜。
如果選擇直接IF,則可在一抗孵育后直接進(jìn)行封片,因為一抗已經(jīng)帶有熒光色素。在間接IF當(dāng)中,二抗現(xiàn)在已經(jīng)對一抗進(jìn)行了熒光標(biāo)記。這里的關(guān)鍵點在于使用一抗進(jìn)行孵育后要進(jìn)行充分清洗,以減少二抗的非特異性結(jié)合。二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進(jìn)行稀釋。如果制造商沒有不同的指示,可以從1:200的稀釋開始,在室溫下孵育1小時。有必要避光培養(yǎng)以防出現(xiàn)熒光色素漂白。
細(xì)胞核染色與樣本封片
免疫反應(yīng)之后通常是用DNA染料對細(xì)胞核染色。另一方面,在用顯微鏡觀察時這種處理可以更好地在細(xì)胞或組織切片內(nèi)進(jìn)行定向,同時還可以指示出細(xì)胞狀態(tài)(如有絲分裂)是否為研究所需的狀態(tài)。即便在沒有透化的情況下也能進(jìn)入到細(xì)胞核并插入DNA中的染料,如Hoechst或DAPI等,可以用于此目的。有鑒于此,實驗人員應(yīng)當(dāng)十分小心,避免這些染料直接與皮膚接觸!室溫下簡單的細(xì)胞染色耗時大約10分鐘,期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。
完成IF步驟后,樣本必須適當(dāng)封片以便于開展顯微鏡檢查。有鑒于此,需要使用封固介質(zhì)(如Mowiol或Prolong Gold)來將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。另外,封固介質(zhì)增加了折射率,有利于使用油浸物鏡進(jìn)行顯微鏡檢查。一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質(zhì),如DABCO,這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。根據(jù)使用的熒光色素,一些抗褪色劑比其他的更有效。
此外,還可使用添加了DNA染料的封固介質(zhì)以便在包埋期間對細(xì)胞核進(jìn)行染色,就無需進(jìn)行單獨的細(xì)胞核染色。如果使用硬化封固介質(zhì)(通常情況下),則允許樣本過夜固化,因此可以在第二天進(jìn)行顯微鏡檢查。以這種方式生產(chǎn)的玻片幾乎可以長時間儲存在室溫或4℃的黑暗環(huán)境中,但請記住,熒光色素的熒光強度會隨著時間的推移而減弱。
通過透化處理,抗體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),否則抗體就無法通過細(xì)胞的脂膜。根據(jù)固定類型,有時需要單獨的透化處理。當(dāng)用有機溶劑固定時,細(xì)胞膜已經(jīng)具有滲透性,您可以直接進(jìn)入封閉步驟。用化學(xué)交聯(lián)劑固定的細(xì)胞需要用清潔劑進(jìn)行額外處理以實現(xiàn)透化。使用Triton X-100或NP-40等傳統(tǒng)清潔劑,但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。同樣,根據(jù)應(yīng)用的物質(zhì)、濃度和培養(yǎng)時間會得到不同的結(jié)果,因此實驗人員應(yīng)該在開始時嘗試不同的參數(shù)。典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。
如果希望通過IF來分析脂質(zhì)相關(guān)蛋白或膜蛋白,則應(yīng)謹(jǐn)慎開展透化步驟(=脂質(zhì)去除)。比較理想的選擇是皂甙,能選擇性去除質(zhì)膜上的膽固醇,使細(xì)胞內(nèi)的膜基本上完好無損。如果在抗體染色前忽略了透化處理(只能通過化學(xué)交聯(lián)劑固定),則可以專門標(biāo)記細(xì)胞外質(zhì)膜結(jié)合抗原,以便將其與胞內(nèi)抗原分開來。核酸染料如DAPI或Hoechst(見‘細(xì)胞核染色和樣本封固’章節(jié))具有膜滲透性,因此不需要透化處理。
封閉
封閉是在細(xì)胞內(nèi)最大限度降低一抗非特異性結(jié)合的重要步驟。為了實現(xiàn)這一點,可以使用來自牛血清白蛋白(BSA)、奶粉或血清的蛋白質(zhì)。關(guān)鍵在于,這些封閉蛋白質(zhì)并不源于產(chǎn)生一抗的物種,否則二抗對于一抗的特異性就會損失。如果您使用的是二抗,如山羊產(chǎn)生的抗小鼠一抗,則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。通常使用濃度為1%(奶粉,BSA)至5%(正常血清)的封閉溶液,并在清洗緩沖液中稀釋。在室溫下孵育30-60分鐘。
免疫反應(yīng)
經(jīng)固定、透化和封閉制備樣本后,會開始進(jìn)行免疫反應(yīng)。樣本現(xiàn)在與特定的一抗一起孵育,以標(biāo)記所需的靶結(jié)構(gòu)。幾種一抗可同時應(yīng)用于樣本。如上所述,在間接多色I(xiàn)F中,幾種一抗必須來源于不同的物種。首先根據(jù)制造商的要求,在選定的封閉溶液中進(jìn)行抗體稀釋。如果對染色不滿意,或者如果制造商沒有提供任何有關(guān)有效稀釋的信息,您應(yīng)該嘗試使?jié)舛缺3衷?:50到1:1000之間。根據(jù)抗體的親和力,孵育時間可能會有所不同。默認(rèn)培育時間為室溫下1-2小時;也可以在4℃下過夜。
如果選擇直接IF,則可在一抗孵育后直接進(jìn)行封片,因為一抗已經(jīng)帶有熒光色素。在間接IF當(dāng)中,二抗現(xiàn)在已經(jīng)對一抗進(jìn)行了熒光標(biāo)記。這里的關(guān)鍵點在于使用一抗進(jìn)行孵育后要進(jìn)行充分清洗,以減少二抗的非特異性結(jié)合。二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進(jìn)行稀釋。如果制造商沒有不同的指示,可以從1:200的稀釋開始,在室溫下孵育1小時。有必要避光培養(yǎng)以防出現(xiàn)熒光色素漂白。
細(xì)胞核染色與樣本封片
免疫反應(yīng)之后通常是用DNA染料對細(xì)胞核染色。另一方面,在用顯微鏡觀察時這種處理可以更好地在細(xì)胞或組織切片內(nèi)進(jìn)行定向,同時還可以指示出細(xì)胞狀態(tài)(如有絲分裂)是否為研究所需的狀態(tài)。即便在沒有透化的情況下也能進(jìn)入到細(xì)胞核并插入DNA中的染料,如Hoechst或DAPI等,可以用于此目的。有鑒于此,實驗人員應(yīng)當(dāng)十分小心,避免這些染料直接與皮膚接觸!室溫下簡單的細(xì)胞染色耗時大約10分鐘,期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。
完成IF步驟后,樣本必須適當(dāng)封片以便于開展顯微鏡檢查。有鑒于此,需要使用封固介質(zhì)(如Mowiol或Prolong Gold)來將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。另外,封固介質(zhì)增加了折射率,有利于使用油浸物鏡進(jìn)行顯微鏡檢查。一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質(zhì),如DABCO,這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。根據(jù)使用的熒光色素,一些抗褪色劑比其他的更有效。
此外,還可使用添加了DNA染料的封固介質(zhì)以便在包埋期間對細(xì)胞核進(jìn)行染色,就無需進(jìn)行單獨的細(xì)胞核染色。如果使用硬化封固介質(zhì)(通常情況下),則允許樣本過夜固化,因此可以在第二天進(jìn)行顯微鏡檢查。以這種方式生產(chǎn)的玻片幾乎可以長時間儲存在室溫或4℃的黑暗環(huán)境中,但請記住,熒光色素的熒光強度會隨著時間的推移而減弱。
圖2 斑馬魚胚胎。用STELLARIS 8獲得3D圖像,細(xì)胞核:藍(lán)色,Hoechst;內(nèi)皮細(xì)胞:綠色,EGFP;細(xì)胞膜:紫色,NIR750。樣本由法國斯*堡的IGBMC的Julien Vermot提供。
對照
免疫熒光必須進(jìn)行適當(dāng)對照,以正確顯示顯微鏡圖像。缺少或不適合的對照通常會導(dǎo)致假陽性結(jié)論和不正確的數(shù)據(jù)。首先應(yīng)當(dāng)分析只被固定、透化和封閉的樣本以便了解細(xì)胞間室的自發(fā)熒光typo3/。有時即使沒有進(jìn)行IF染色,結(jié)構(gòu)也可能出現(xiàn)強熒光信號。
為了進(jìn)一步的對照和調(diào)整間接IF的顯微鏡參數(shù),使用已采用上述方法進(jìn)行處理過的樣本,但樣本還要額外使用二抗進(jìn)行孵育。首先將揭示二抗與樣本的強非特異性結(jié)合。其次,設(shè)置顯微鏡參數(shù)以便在該對照的圖像采集期間不記錄任何信號。此設(shè)置用作后續(xù)采集的閾值來排除二抗的假陽性信號。在直接IF當(dāng)中,自體熒光對照用于調(diào)節(jié)閾值。接下來分析與特異性一抗一起孵育的樣本,如果是間接IF,也分析與二抗一起孵育的樣本。此時應(yīng)可檢測到熒光信號,其高于自發(fā)熒光和二抗的陰性對照。
為了確保一抗特異性標(biāo)記所需結(jié)構(gòu),一些制造商為一抗提供遮蔽特定抗原的肽封閉,從而防止抗體與其表位結(jié)合。如此處理成本高昂,但也是確定抗體特異性的最佳方法,因此得到可靠的結(jié)果。
在多色I(xiàn)F實驗中還必須注意所選熒光色素之間的串?dāng)_。如果是第一次進(jìn)行多色I(xiàn)F檢查,建議在單獨的制備中另外染色靶向結(jié)構(gòu),并將這些圖像與多色圖像進(jìn)行比較。最后應(yīng)該仔細(xì)查看所獲得的數(shù)據(jù)并將其與您的期望和一抗的現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
表2:哪些對照測試哪些內(nèi)容
局限性
如前所述,IF檢查有諸多優(yōu)勢,但同樣也存在著一定的劣勢。關(guān)鍵點是樣本的固定:固定意味著滅活,因此活細(xì)胞成像已變得不再可能。因此對動態(tài)過程的分析會比較復(fù)雜,每個時間點上的細(xì)胞都必須予以固定和染色。所以快速動態(tài)過程無法通過IF來進(jìn)行觀察。這顯然是融合蛋白表達(dá)熒光標(biāo)記如GFP(綠色熒光蛋白)的優(yōu)勢,比較適合用于活細(xì)胞成像。
如上所述,IF實驗過程中(固定/透化)會改變細(xì)胞結(jié)構(gòu),因此偽影可解釋為假陽性信號。所以有必要為每個IF染色準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)膶φ掌?,可能很費時。另一個缺點同樣不可避免:熒光染料的光漂白。像GFP這樣的熒光蛋白也受此影響,但當(dāng)儲存在適當(dāng)?shù)臈l件下,即使在幾個月的制備后,GFP也能被檢測到。相反,IF熒光色素的強度損失更快,這反映在顯微鏡下樣本的快速漂白。即使是用抗褪色劑封固介質(zhì)也只能暫時起作用。
圖4:整套程序的流程圖
標(biāo)準(zhǔn)IF流程
IF實驗所需時間:約5個小時。
這是一種蓋玻片上通過化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行固定的培育細(xì)胞接受間接IF檢查的標(biāo)準(zhǔn)方案。
· 濕盒非常適合IF實驗,并且可以輕松完成自制(見幻燈片“如何制備濕盒")。該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng),這對于處理熒光色素很重要,并且對于已經(jīng)存在的熒光蛋白是必要的。
· 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠*濕潤。確保樣本絕對不會*干燥。
· 所有培育步驟都在室溫下完成。
1. 清洗細(xì)胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉(zhuǎn)細(xì)胞的蓋玻片放入濕盒。
2. 使用4% 福爾馬林進(jìn)行10分鐘的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS進(jìn)行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進(jìn)行45分鐘的封閉(無需清洗)。
5. 在封閉溶液內(nèi)稀釋一抗并使用2小時(或在4℃下連夜使用)。清洗4次將未結(jié)合的一抗*清除掉。
6. 使用二抗進(jìn)行1個小時的孵育,在封閉溶液或清洗緩沖液內(nèi)進(jìn)行稀釋。
7. 吸取二抗,如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS當(dāng)中孵育10分鐘。*清洗4次,即便此時還沒有出現(xiàn)細(xì)胞核染色。
8. 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其進(jìn)入H2O內(nèi),清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
9. 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細(xì)胞倒置這滴溶液上。用鑷子輕輕按壓試樣,使封固介質(zhì)均勻分布而不會擠壓樣本。
10.固化后就準(zhǔn)備好進(jìn)行顯微鏡觀察了。
配方
清洗緩沖液
· 1 × PBS(磷酸鹽生理鹽水緩沖液)
1. 137 mM:NaCI
2. 2.7 mM:KCI
3. 10mM:Na2HPO4
4. 1.8 mM:KH2PO4
清洗緩沖液
· 1 × PBS(磷酸鹽生理鹽水緩沖液)
1. 137 mM:NaCI
2. 2.7 mM:KCI
3. 10mM:Na2HPO4
4. 1.8 mM:KH2PO4
· 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4
· 如為PBS++,需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T,需添加最終濃度為0.05%的Tween 20
固定緩沖液
· 福爾馬林:
1. 將4% PFA(多聚甲醛)溶解于溫暖(50-70℃)的dH2O當(dāng)中,pH值8(使用NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié))。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當(dāng)中(如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O)。
3. 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4。
· 甲醇(預(yù)先冷凍至-20℃):
1. 100%甲醇(-20℃)
· 如為PBS++,需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T,需添加最終濃度為0.05%的Tween 20
固定緩沖液
· 福爾馬林:
1. 將4% PFA(多聚甲醛)溶解于溫暖(50-70℃)的dH2O當(dāng)中,pH值8(使用NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié))。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當(dāng)中(如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O)。
3. 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4。
· 甲醇(預(yù)先冷凍至-20℃):
1. 100%甲醇(-20℃)
· 甲醇/丙酮(預(yù)先冷凍至 -20℃):
1. 50%甲醇(-20℃)和50 %丙酮(-20℃)
1. 50%甲醇(-20℃)和50 %丙酮(-20℃)
透化緩沖液
· TX-100(Triton X-100):
1. PBS,最終濃度0.1% TX-100
1. PBS,最終濃度0.1% TX-100
· 皂甙:
1. PBS,最終濃度0.1%的皂甙
· 其他清潔劑可在PBS當(dāng)中以相同濃度進(jìn)行使用。
1. PBS,最終濃度0.1%的皂甙
· 其他清潔劑可在PBS當(dāng)中以相同濃度進(jìn)行使用。
封閉緩沖液
· BSA(牛血清蛋白):
1. PBS,最終濃度為1% BSA
· BSA(牛血清蛋白):
1. PBS,最終濃度為1% BSA
· 奶粉:
1. PBS,最終濃度為1%奶粉
1. PBS,最終濃度為1%奶粉
· 正常血清:
1. PBS,最終濃度為5%正常血清
1. PBS,最終濃度為5%正常血清
細(xì)胞核染料
· Hoechst或DAPI:
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液,最終工作濃度為1 μg/mL。
· Hoechst或DAPI:
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液,最終工作濃度為1 μg/mL。