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光譜檢測(cè)-如何設(shè)定特定探針發(fā)射光的光譜檢測(cè)范圍

點(diǎn)擊次數(shù):870 更新時(shí)間:2022-04-18


為了拆分多色成像的發(fā)射光譜,首先由分束器或色散元件將不同顏色的光引入到不同的方向[1],帶通濾片則能夠最大限度地減少串色,并抑制所有殘留的激發(fā)光,最終到達(dá)傳感器。在過去,常使用的濾片是普通的玻璃帶通濾片。如今,一項(xiàng)革命性的設(shè)計(jì)誕生了,那就是在多波段組件(探測(cè)器)中使用光度計(jì)滑塊。該設(shè)計(jì)可以極為有效地探測(cè)發(fā)射光,同時(shí)提供*可調(diào)諧性,與此同時(shí)帶來的好處是使光譜掃描成為了可能。使用白激光作為光源時(shí),可調(diào)諧光譜檢測(cè)器是與可調(diào)諧光源光譜自由度匹配的設(shè)備。其他的光譜檢測(cè)設(shè)備使用一系列檢測(cè)元件,其波段是固定的,但它們不可調(diào)諧,靈敏度較低。

 
玻濾光片
在以前,熒光顯微鏡總是使用玻璃濾光片作為屏障濾光片。極早期的熒光顯微鏡是透射系統(tǒng),即它們?cè)谕干涔庀逻M(jìn)行操作。后來該技術(shù)*被反射光束路徑(落射光)取代,入射光系統(tǒng)可以更好的進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射分離。由于熒光強(qiáng)度僅為照明的約10-4到10-10[2],所以這是一個(gè)至關(guān)重要的要求。屏障濾光片必須完成兩個(gè)任務(wù):首先,盡量阻擋雜散光(由于樣品或光學(xué)組件中的反射,殘留激發(fā)光到達(dá)探測(cè)光路)。其次,如果樣品含有多種熒光物質(zhì)(減少串色),屏障濾光片可以進(jìn)一步縮小收集的光譜帶寬以增強(qiáng)通道信號(hào)的特異性。
玻璃濾光片可能由有色玻璃材料制成,有多種不同顏色。然而,有色玻璃的性能取決于其使用的化合物,除了混合各種化學(xué)品來接近所需的透射性質(zhì)外,沒有其他方法來設(shè)計(jì)光譜特性。在設(shè)計(jì)上更靈活的濾光片基于多層涂層(沉積在透明玻璃上)。這種涂層或多或少為設(shè)計(jì)可見光譜內(nèi)的任何帶通提供了選擇。可以用更復(fù)雜的涂層作為多通濾片,具有三個(gè)或四個(gè)透射波段,中間有反射部分,允許多重激發(fā)和檢測(cè)。
盡管多層涂層技術(shù)非常先進(jìn),但此類設(shè)備的局限性在于其不可調(diào)性。為了用于多種染料之間的組合,系統(tǒng)必須配備一組此類濾光片,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,這些濾片必須通過手動(dòng)或電動(dòng)操作插入光路。這使得基于濾片的系統(tǒng)的靈活性變差,實(shí)驗(yàn)效率低下。
 
圖1:基于有色玻璃或干涉涂層的經(jīng)典帶通濾片。要更改探測(cè)光譜區(qū)間,必須更換濾片。這需要許多濾光片和電動(dòng)交換裝置(©–.)。
多波段分光光度計(jì):探測(cè)器
還有一種*不同的方法可以從整個(gè)光譜中選擇所需波段,即使用與光譜重疊的機(jī)械設(shè)備。如果一束光穿過色散元件(棱鏡或光柵),色散后的光會(huì)根據(jù)其能量在空間上擴(kuò)散,光子的能量與顏色相對(duì)應(yīng)。舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子,將色散后的光投影到白色表面上,即可觀察到生成的光譜。長(zhǎng)期以來,人們用相紙來記錄和定量。而現(xiàn)在,人們用數(shù)碼相機(jī)芯片來查看和分析光譜分光鏡)。
除此以外,也可以通過在白色表面的位置插入機(jī)械狹縫,并測(cè)量透射能量來從整個(gè)光譜中選擇一個(gè)窄帶。狹縫的位置可以在光譜上移動(dòng),然后測(cè)量能量分布作為位置的函(光譜儀)。
不同顏色的發(fā)射光對(duì)應(yīng)的能量也不同。為了檢測(cè)樣本發(fā)射光的全部能量,需要打開狹縫并將其居中,檢測(cè)窗口就會(huì)覆蓋發(fā)射光譜,并屏蔽光譜的其他部分。這種器件是一種帶通濾波器,它的優(yōu)點(diǎn)是中心頻率和帶寬都可調(diào)諧——它包括任何(單)帶通濾波器的可能。此類器件與適當(dāng)?shù)膫鞲衅鳎ɑ颍┙Y(jié)合使用,就成為了共聚焦顯微鏡通用、靈敏的檢測(cè)器。
如前所述,頻帶光譜儀只能用于單通道實(shí)驗(yàn)。然而,生物醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)代熒光實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)通道。通過串聯(lián)機(jī)械狹縫裝置可以巧妙地解決這個(gè)問題[3]。在這種多波段探測(cè)系統(tǒng)(后稱為“探測(cè)器")中,機(jī)械狹縫元件類似于高反射鏡。第一個(gè)通道所需的波段通過狹縫后,光譜的其余部分被引導(dǎo)到后續(xù)的探測(cè)器(幾乎無(wú)損失),到達(dá)這些探測(cè)器之前再次被反射鏡滑塊進(jìn)行選擇。理論上,可以無(wú)限串聯(lián)這種波段探測(cè)器。由于現(xiàn)實(shí)原因,目前的設(shè)備最多備5個(gè)傳感器。
該設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是效率高(狹縫透過率100%,反射鏡反射率99%),所有波段的獨(dú)立自由光譜都可以進(jìn)行調(diào)諧。當(dāng)用白激光(可調(diào)諧光源)進(jìn)行照明時(shí),探測(cè)器是一個(gè)能合理地整合激發(fā)的高度靈活的裝置。此外,每個(gè)通道都配有專用的傳感器,可以進(jìn)行獨(dú)立的電子放大和基線設(shè)置。

圖2:探測(cè)器采用玻璃棱鏡,具有高透射率和分光性能。通過可移動(dòng)的反射鏡滑塊將光譜分成多個(gè)波段。這使得光譜可以分成任何可能的子光譜集,然后被檢測(cè)器通道測(cè)。。
 
其他方法
繼檢測(cè)器后,其他的一些設(shè)計(jì)相繼問世,旨在配合多波段方法的優(yōu)勢(shì)。其中之一陣列檢測(cè)器,通常是多陽(yáng)極光電倍增管,將光譜投射到其上[4,5]。雖然這些設(shè)備可以更簡(jiǎn)單地放大檢測(cè)信號(hào),但它們有明顯的缺點(diǎn):由于必須對(duì)不同部分進(jìn)行機(jī)械分離,使用多陽(yáng)極陣列會(huì)使得收集的光子減少。它們受到光電串?dāng)_的影響,無(wú)法單獨(dú)調(diào)整放大功率。這些波段本質(zhì)上是固定的,即不可調(diào)諧,因此無(wú)法適用于當(dāng)今使用的熒光染料的各種發(fā)射特性——未來發(fā)射特性會(huì)越來越復(fù)雜。這些設(shè)備不輸出分配給單個(gè)發(fā)射種類的信號(hào),而只是輸出光譜的固定部分。因此,它們必須要通過分解算法對(duì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理,以獲得有意義的通道數(shù)據(jù)。(使用探測(cè)器,將信號(hào)分配給不同發(fā)射種類,此時(shí)分離可以清除殘留重疊。)
陣列探測(cè)器還強(qiáng)制要求發(fā)射光具備線性色散。因此無(wú)法在配備了陣列探測(cè)器的系統(tǒng)中使用棱鏡,所以只能使用光柵,但其性能具有重大缺陷。第一,光柵輸出不均一,衍射的最大值位于閃耀波長(zhǎng)處。因此,在較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)下收集的數(shù)據(jù)低于真實(shí)值。第二,光柵對(duì)偏振的依賴性很強(qiáng),對(duì)非偏振光(這是生物熒光發(fā)射的典型情況)的衍射效率會(huì)降低到50-70%左右(針對(duì)表現(xiàn)好的顏色)。因此需要使用其他光學(xué)元件彌補(bǔ)該缺陷[6]。光柵的第三個(gè)問題是:輸入能量不僅在單一光譜中釋放,而且還釋放進(jìn)入了0階和更高階的散射光中去。這降低了所有光柵的整體衍射效率。同樣也引入了其他更多的光學(xué)設(shè)備來解決這個(gè)問題[7]。
這些設(shè)備都是基于記錄光譜的理念而設(shè)計(jì)的。然而,除非在非常罕見的情況下,熒光成像不需要記錄光譜。熒光成像需要重新計(jì)算低效獲得的光譜以提供有意義的染料信息。探測(cè)器不會(huì)受到高階損耗的影響,也不會(huì)受到偏振相關(guān)的影響。它提供*可調(diào)的檢測(cè)帶,并具有單獨(dú)的放大功能。它可以進(jìn)行線性分解處理,這是一個(gè)額外的優(yōu)勢(shì)—意味著同時(shí)也可以在高分辨率下記錄光譜[8]。因此將可調(diào)白激光與可調(diào)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行組合是非合理的。
 
圖3:?jiǎn)吸c(diǎn)探測(cè)器(探測(cè)器)可以調(diào)整樣品中各種染料發(fā)射的動(dòng)態(tài)差異。與多陽(yáng)極陣列探測(cè)器相反,兩個(gè)探測(cè)窗口都是可調(diào)的,并且可以單獨(dú)調(diào)整動(dòng)態(tài)范圍。

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